久久99国产精品尤物-国产高清色播视频免费看-男生肌肌往女人桶爽视频-精品国产-91PORNY九色|www.jqdstudio.net

       今天看到一則消息，很是震驚：在美國《The Scientist》雜志官網上找到一條新聞《實驗室制造的新型冠狀病毒引發爭論》，顯示美國在2015年就在SARS基礎上制造出一種新型冠狀病毒，可引發人類高傳染性肺炎，并發表在《自然》雜志上，科學界對該研究可能帶給人類社會巨大風險展開爭論。

為此，小編求證了原網站https://www.the-scientist.com/news-opinion/lab-made-coronavirus-triggers-debate-34502?archived_content=9BmGYHLCH6vLGNdd9YzYFAqV8S3Xw3L5

實驗室制造的冠狀病毒引發爭論

一種類似SARS的嵌合病毒的產生讓科學家們討論了獲得功能研究的風險。

2015年11月16日

杰夫阿克斯特

1.1公里

MERS冠狀病毒

FLICKR，尼亞德

北卡羅萊納大學教堂山分校傳染病研究員拉爾夫·巴里克上周（11月9日）發表了一份研究報告，介紹了他的團隊如何利用在中國馬蹄蝠中發現的SHC014冠狀病毒的表面蛋白，以及導致類人嚴重急性呼吸綜合征的病毒的主干，來設計一種病毒（非典）在老鼠身上。研究小組發表在《自然醫學》雜志上的研究結果顯示，這種混合病毒可以感染人類氣道細胞，并在小鼠身上引發疾病。

《自然》雜志報道，這一結果證明了SHC014表面蛋白結合和感染人類細胞的能力，證實了人們的擔憂，即蝙蝠物種中發現的這種病毒或其他冠狀病毒可能能夠在不首先在中間宿主中進化的情況下向人類飛躍。他們還重新引發了一場關于這些信息是否證明了這項工作的風險的爭論，這項工作被稱為功能獲得研究。巴黎巴斯德研究所（Pasteur Institute）的病毒學家西蒙·韋恩·霍布森（Simon Wain Hobson）告訴《自然》雜志：“如果（新的）病毒逃走了，沒有人能預測出它的軌跡。”。

2013年10月，美國政府停止了所有為功能獲得研究提供的聯邦資金，尤其是對流感、非典和中東呼吸綜合征（MERS）的關注。美國國立衛生研究院院長柯林斯（Francis Collins）當時在一份聲明中說：“美國國立衛生研究院（National Institutes of Health）資助這類研究，是因為它們有助于界定人類病原體相互作用的基本性質，有助于評估新出現傳染源的大流行潛力，并為公共衛生和防備工作提供信息。”。“然而，這些研究還涉及生物安全和生物安保風險，需要更好地理解這些風險。”

巴里克對《自然》雜志說，巴里克對SHC014嵌合體冠狀病毒的研究是在宣布暫停前開始的，國家衛生研究院允許它在審查過程中進行，最終得出結論，這項工作不屬于新的限制。但是一些研究人員，比如懷恩·霍布森，不同意這個決定。

爭論歸根結底在于結果的信息量有多大。羅格斯大學的分子生物學家和生物防御專家理查德·埃布賴特告訴《自然》雜志：“這項工作的唯一影響是在實驗室里創造出一種新的非自然風險。”。

但巴里克和其他人認為這項研究的重要性。生態健康聯盟（EcoHealth Alliance）主席彼得·達扎克（Peter Daszak）對《自然》雜志說：“（研究結果）將這種病毒從一種候選的新出現的病原體轉移到一種明顯的、當前的危險中。”。

關鍵詞：

蝙蝠傳染性非典型肺炎的功能研究

論文鏈接：

發布時間：2015年11月9日

一個類似SARS的蝙蝠冠狀病毒群顯示了人類出現的可能性

維內特·德梅納赫里，小博伊德·L·尤恩特，卡麗·德賓克，蘇達卡·阿格尼霍特拉姆，麗莎·E·格拉林斯基，杰西卡·A·普蘭特，瑞秋·L·格雷厄姆，特雷弗·斯科比，邢易戈，埃里克·F·唐納森，斯科特·H·蘭德爾，安東尼奧·蘭扎維奇亞，韋恩·A·馬拉斯科，鄭莉·施&拉爾夫·S·巴里克

《自然醫學》第21卷第1508-1513頁（2015年）引用本文

本文的更正于2016年4月6日發布

本文已更新

摘要

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征（MERS-CoV）的出現突出了跨物種傳播事件導致人類爆發的威脅。在這里，我們研究了一種SARS樣病毒SHC014-CoV的潛在致病性，這種病毒目前在中國馬蹄蝠種群中傳播1。利用SARS-CoV反向遺傳學系統2，我們在小鼠適應SARS-CoV的脊骨中產生并鑒定了一種表達蝙蝠冠狀病毒SHC014峰的嵌合病毒。結果表明，在野生型主干中編碼SHC014峰的2b組病毒能有效地利用SARS受體人血管緊張素轉換酶II（ACE2）的多個同源基因，在原代人氣道細胞中高效復制，并在體外獲得與SARS-CoV流行株相當的效價。此外，體內實驗顯示嵌合病毒在小鼠肺中的復制具有顯著的發病機制。對現有的基于SARS的免疫治療和預防方法的評估顯示效果不佳；單克隆抗體和疫苗方法均未能中和和保護使用新的spike蛋白的CoVs感染。在此基礎上，我們合成了一株具有感染性的全長SHC014重組病毒，并證明了該病毒在體內外的復制能力。我們的研究表明，目前在蝙蝠種群中傳播的病毒有可能再次出現SARS-CoV。主要SARS-CoV的出現預示著全球范圍內嚴重呼吸系統疾病的跨物種傳播進入了一個新的時代，并在全球范圍內迅速蔓延，產生了巨大的經濟影響。從那時起，動物種群中出現了包括甲型流感病毒株H5N1、H1N1和H7N9以及MERS-CoV在內的幾種病毒株，給疫區造成了相當大的疾病、死亡率和經濟困難5。盡管公共衛生措施能夠阻止SARS-cov4的爆發，但最近的亞基因組學研究已經確定了在中國蝙蝠種群中傳播的與SARS密切相關的病毒序列，這些病毒可能構成未來的威脅。然而，序列數據本身提供了識別和準備未來的盤前病毒的最小洞察力。因此，為了研究循環蝙蝠冠狀病毒的出現可能性（即感染人類的可能性），我們構建了一種嵌合病毒，該病毒編碼一種新的人畜共患冠狀病毒尖峰蛋白，該蛋白來自于從中國馬蹄蝠1分離的RsSHC014冠狀病毒序列，其背景是SARS冠狀病毒小鼠適應的脊骨。這種雜交病毒使我們能夠評估這種新的棘突蛋白引起疾病的能力，而不依賴于其自然主干上其他必要的適應性突變。利用這一方法，我們在原代人氣道細胞和體內鑒定了SHC014棘突蛋白介導的CoV感染，并測試了現有免疫療法對SHC014-CoV的療效。綜合起來，該策略翻譯了宏基因組學數據，以幫助預測和準備未來的緊急病毒。

SHC014和相關RsWIV1冠狀病毒的序列顯示，這些冠狀病毒是與流行性SARS冠狀病毒株最接近的親緣病毒（圖1a，b）；然而，與SARS冠狀病毒受體人ACE2結合的14個殘基存在重要差異，包括對宿主范圍至關重要的5個殘基：Y442、L472、N479、T487和Y491（參考文獻7）。在WIV1中，其中三種殘基與流行性SARS-CoV-Urbani株不同，但預計它們不會改變與ACE2的結合（補充圖1a、b和補充表1）。這一事實得到了兩個假分型實驗的證實，即測量編碼WIV1棘突蛋白的慢病毒進入表達人ACE2的細胞的能力（補充圖1）和WIV1-CoV的體外復制分析（參考文獻1）。相比之下，SHC014中14個ACE2相互作用殘基中有7個不同于SARS冠狀病毒，包括對宿主范圍至關重要的所有5個殘基（補充圖1c和補充表1）。這些變化，加上表達SHC014峰的假型慢病毒未能進入細胞（補充圖1d），表明SHC014峰不能結合人類ACE2。然而，在相關的SARS-CoV株中也有類似的變化，以允許ACE2結合7,8，這表明需要額外的功能測試來驗證。因此，我們在復制能力、小鼠適應的SARS冠狀病毒骨架（以下我們將嵌合CoV作為SHC014-MA15）的上下文中合成了SHC014穗，以最大限度地發揮小鼠發病機制和疫苗研究的機會（附圖2A）。盡管基于結構的建模和假分型實驗都有預測，但SHC014-MA15是可行的，并在Vero細胞中復制到高滴度（補充圖2b）。與SARS類似，SHC014-MA15也需要一個功能性ACE2分子進入，可以使用人、麝香貓和蝙蝠ACE2同源物（補充圖2c、d）。為了測試SHC014峰介導人氣道感染的能力，我們檢測了人上皮性氣道細胞系Calu-3 2B4（參考文獻9）對感染的敏感性，發現SHC014-MA15復制能力強，與SARS CoV Urbani相似（圖1c）。為了擴展這些發現，原代人氣道上皮（HAE）培養物被感染并顯示出兩種病毒的強大復制（圖1d）。總之，這些數據證實了SHC014尖峰病毒感染人類氣道細胞的能力，并強調了SHC014 CoV跨物種傳播的潛在威脅。圖1:SARS樣病毒在人氣道細胞中復制并產生體內發病機制。

（a） 代表性cov的全長基因組序列按照在線方法進行了排列和系統發育圖譜繪制。比例尺代表核苷酸替換，只有超過70%的引導支持被標記。樹狀圖顯示CoVs可分為三個不同的系統發育類群，分別為α-CoVs、β-CoVs和γ-CoVs。經典的亞群簇被標記為2a、2b、2c和2d（β-CoVs）和1a和1b（α-CoVs）。（b） 對包括SARS-CoV在內的2b組具有代表性的β-CoV的S1區序列進行了序列比對和系統發育定位。刻度條代表氨基酸替代。（c，d）兩種細胞感染Calu-32b4細胞（c）或分化良好的一級氣液界面HAE細胞培養物（d）后，SARS-CoV-Urbani（黑色）和SHC014-MA15（綠色）的病毒復制，感染倍數（MOI）均為0.01。用生物復制物（n=3）在個別時間點收集Calu-3和HAE實驗的樣本。（e，f）10周齡BALB/c小鼠經鼻（i.n.）途徑感染1×104 p.f.u.小鼠適應的SARS-CoV MA15（黑色）或SHC014-MA15（綠色），體重減輕（n=9，SHC014-MA15（e）；n=16，肺部病毒復制（n=3，SARS-CoV MA15；n=4，SHC014-MA15）。（g，h）顯示了感染SARS-CoV-MA15（N=3只小鼠）（g）或SHC014-MA15（N=4只小鼠）（h）的小鼠肺切片的代表性圖像。對于每個圖形，中心值表示組平均值，誤差條定義s.e.m.比例尺，1 m m。

全尺寸圖像

為了評估SHC014峰在體內介導感染中的作用，我們用104個SARS-MA15或SHC014-MA15的斑塊形成單位（p.f.u.）感染10周齡BALB/c小鼠（圖1e-h）。感染SARS-MA15的動物在感染后4d（d.p.i.）體重迅速下降并致死；相比之下，感染SHC014-MA15的小鼠體重顯著下降（10%），但沒有致死性（圖1e）。病毒復制檢查顯示，感染SARS-MA15或SHC014-MA15的小鼠肺部的病毒滴度幾乎相等（圖1f）。SARS-MA15感染小鼠的肺在終末細支氣管和肺實質2 d.p.i（圖1g）中均顯示強染色，而SHC014-MA15感染小鼠的肺則顯示氣道抗原染色減少（圖1h）；相反，在肺實質或整個組織學評分中未觀察到抗原染色缺陷，提示SHC014-MA15肺組織的差異性感染（補充表2）。我們接下來分析了更易感的、年齡較大（12個月大）的動物的感染情況。SARS-MA15–感染動物迅速減肥并死于感染（補充圖3a、b）。SHC014-MA15感染可誘導健康和持續的體重下降，但致死率最低。我們在幼鼠中觀察到的組織學和抗原染色模式的趨勢在老年動物中保持不變（補充表3）。我們排除了SHC014-MA15通過替代受體介導感染的可能性，這是基于使用Ace2-/-小鼠進行的實驗，在SHC014-MA15感染后沒有顯示體重減輕或抗原染色（補充圖4a、b和補充表2）。總之，這些數據表明，具有SHC014尖峰的病毒能夠在小鼠體內誘導毒性CoV主干的情況下減輕體重。

鑒于埃博拉單克隆抗體療法（如ZMApp10）的臨床前療效，我們接下來試圖確定SARS-CoV單克隆抗體對SHC014-MA15感染的療效。四種廣譜中和的抗SARS冠狀病毒尖峰蛋白單克隆抗體已被報道，是可能的免疫治療試劑11，12，13。我們檢測了這些抗體對病毒復制的影響（表示為病毒復制的抑制百分比），發現雖然野生型SARS-CoV-Urbani在相對較低的抗體濃度下被所有四種抗體強烈中和（圖2a-d），但SHC014-MA15的中和作用不同。由噬菌體展示和逃逸突變體11，12產生的抗體Fm6，僅達到抑制SHC014-MA15復制的背景水平（圖2a）。同樣，從SARS-CoV感染患者13的記憶B細胞中獲得的抗體230.15和227.14也未能阻斷SHC014-MA15的復制（圖2b、c）。對于這三種抗體，SARS和SHC014尖峰氨基酸序列之間的差異對應于SARS-CoV逃逸突變體（fm6-N479R；230.15-L443V；227.14-K390Q/E）中直接或相鄰的殘基變化，這可能解釋了抗體對shc2014的中和活性的缺失。最終，單克隆抗體109.8能夠達到圖2:SARS-CoV單克隆抗體對類SARS-CoV的作用不大。

（a–d）中和試驗評估一組單克隆抗體的療效（以減少斑塊數量衡量），這些單克隆抗體最初都是針對流行性SARS-CoV產生的，對Vero細胞感染SARS-CoV-Urbani（黑色）或SHC014-MA15（綠色）的效果。檢測的抗體為fm6（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=5）、11、12（a）、230.15（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=2）（b）、227.15（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=5）（c）和109.8（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=2）13（d）。每個數據點代表定義s.e.m.的組平均值和誤差條。注意，b、c中受SARS-CoV-Urbani感染的Vero細胞中的誤差條被符號重疊，不可見。

全尺寸圖像

為了評價現有疫苗對SHC014-MA15感染的效力，我們用雙滅活的SARS冠狀病毒（DIV）接種老齡小鼠。先前的研究表明，DIV可以中和和保護幼鼠免受同源病毒14的攻擊；然而，該疫苗未能保護老齡動物，在老齡動物中還觀察到增強的免疫病理學，這表明動物可能因接種而受到傷害15。在這里，我們發現DIV并不能保護SHC014-MA15免受與體重減輕或病毒滴度有關的挑戰（補充圖5a，b）。與之前關于其他異種組2b-CoVs15的報告一致，來自已接種DIV的老齡小鼠血清也未能中和SHC014-MA15（補充圖5c）。值得注意的是，DIV疫苗接種導致強大的免疫病理學（補充表4）和嗜酸性粒細胞增多癥（補充圖5d-f）。總之，這些結果證實DIV疫苗對SHC014的感染沒有保護作用，并且可能增加老年接種組的疾病。

與DIV疫苗相比，SHC014-MA15作為減毒活疫苗對SARS冠狀病毒的攻擊具有潛在的交叉保護作用，但其結果有重要的注意事項。我們用104 p.f.u.的SHC014-MA15感染幼鼠并觀察28天。然后在第29天用SARS-MA15攻擊小鼠（補充圖6a）。使用高劑量SHC014-MA15的小鼠先前的感染可保護其免受致命劑量的SARS-MA15的攻擊，盡管在SHC014-MA15感染后28天，從所誘發的抗血清中只有最小的SARS-CoV中和反應（補充圖6b，1:200）。在沒有二級抗原增強的情況下，28 d.p.i.代表預期的抗體滴度峰值，并暗示隨著時間的推移，對SARS-CoV的保護作用將減弱16,17。在老年BALB/c小鼠身上觀察到了類似的結果，表明用致死劑量的SARS-CoV可以防止體重減輕和病毒復制（補充圖6c，d）。然而，104 p.f.u.的SHC014-MA15感染劑量誘導一些老年動物的體重減輕和致死率大于10%（圖1和補充圖3）。我們發現，用較低劑量的SHC014-MA15（100p.f.u.）接種疫苗不會導致體重下降，但也不能保護老年動物免受SARS-MA15致死劑量挑戰（補充圖6e，f）。總之，這些數據表明，SHC014-MA15的挑戰可能通過保守的表位提供對SARS冠狀病毒的交叉保護，但所需的劑量會誘發發病并阻止作為減毒疫苗使用。

在確定SHC014尖峰具有介導人類細胞感染和在小鼠中引起疾病的能力之后，我們接下來基于用于SARS-CoV的方法合成了全長SHC014-CoV感染克隆（圖3a）2。與SARS-CoV相比，SHC014-CoV在Vero細胞中的復制沒有缺陷（圖3b）；然而，SHC014-CoV在感染后24和48小時在原代培養的HAE中明顯減弱（P<0.01）（圖3c）。與SARS-CoV-Urbani相比，小鼠體內感染SHC014-CoV后體重沒有明顯下降，但肺部病毒復制減少（圖3d，e）。這些結果共同證實了全長SHC014-CoV的生存能力，但提示其在人類呼吸細胞和小鼠中的復制與SARS-CoV相當需要進一步的適應。圖3：全長SHC014冠狀病毒在人體呼吸道復制，但缺乏傳染性非典型肺炎冠狀病毒的毒力。

（a） SHC014 CoV分子克隆的示意圖，其合成為六個相鄰的cDNA（指定為SHC014A、SHC014B、SHC014C、SHC014D、SHC014E和SHC014F），其兩側有獨特的BglI位點，可定向組裝表達開放閱讀框（1a、1b、spike、3、envelope、matrix、6–8和核衣殼）的全長cDNA。帶下劃線的核苷酸代表限制性內切酶裂解后形成的懸垂序列。（b，c）Vero細胞感染后SARS-CoV-Urbani（黑色）或SHC014-CoV（綠色）的病毒復制（b）或分化良好的一級氣液界面HAE細胞培養（c），MOI為0.01。在各時間點采集樣本，每組進行生物復制（n=3）。數據代表了Vero和HAE細胞的一個實驗。（d，e）通過i.n.途徑感染1×105 p.f.u.的SARS-CoV MA15（灰色）、SHC014-CoV（綠色）或SARS-CoV Urbani（黑色）的10周齡BALB/c小鼠的體重減輕（n=3，SHC014-CoV；n=6，SARS-Urbani）（d）和肺部病毒復制（n=3，SARS-Urbani和SHC014-CoV）（e）。每個數據點代表組的平均值，誤差條定義了s.e.m.*P<0.01和***P<0.001，使用學生對單個時間點的雙尾t檢驗。

在SARS-CoV流行期間，棕櫚麝香貓和人類4中檢測到的CoV株之間很快建立了聯系。在這一發現的基礎上，普遍出現的范式認為，傳染性非典型肺炎冠狀病毒起源于蝙蝠病毒，跳轉到麝貓身上，并在受體結合域（RBD）內加入變化，以改善與麝貓Ace2的結合（參考文獻18）。隨后暴露在活的動物市場中的人允許人感染麝香貓株，而麝香貓株又適應成為流行株（圖4a）。然而，系統發育分析表明，早期人類SARS病毒株與蝙蝠病毒株的親緣關系比與麝香貓病毒株18的親緣關系更為密切。因此，第二種模式認為，蝙蝠與人的直接傳播引發了SARS-CoV的出現，而棕櫚麝香貓是繼續感染的第二宿主和宿主（圖4b）19。對于這兩種模式，第二宿主的棘突適應被認為是必要的，大多數突變預計發生在紅細胞內，從而促進改善感染。這兩種理論都暗示蝙蝠冠狀病毒庫是有限的，宿主范圍的突變是隨機的和罕見的，降低了人類未來出現事件的可能性。圖4：冠狀病毒的出現模式。

維持在蝙蝠種群中循環的準種池中。（a，b）傳統的SARS-CoV發生理論認為，宿主范圍的突變（紅圈）代表了隨機和罕見的情況，允許替代宿主的感染。第二宿主模式（a）認為，非人類宿主被蝙蝠前體病毒感染，通過適應，有助于傳播給人類；隨后在人類中的復制導致流行性病毒株。直接模式（b）表明，蝙蝠和人類之間的傳播不需要中間宿主的要求；然后在人類種群中進行選擇，與之密切相關的病毒在第二宿主中復制，從而允許病毒在兩者中持續存在和適應。（c） 來自類似SARS的嵌合體病毒的數據表明，準物種庫保持了多種病毒能夠在不需要突變的情況下感染人類細胞（紅圈）。盡管流行病的發生可能需要在二級宿主或人類宿主中進行適應，但如果SHC014含穗病毒與毒性CoV骨干（綠色輪廓的圓圈）重組，那么流行病可能是人類的結果。現有數據支持所有三種范式的元素。

盡管我們的研究并沒有使其他的出現途徑失效，但它確實支持第三種模式，即循環的蝙蝠-冠狀病毒池保持“穩定”的棘突蛋白，這種蛋白能夠在沒有突變或適應的情況下感染人類（圖4c）。這一假設通過一種在SARS冠狀病毒主干中含有SHC014峰的嵌合病毒在人類氣道培養物和沒有RBD適應的小鼠中引起強烈感染的能力得到了證實。再加上對先前發現的致病性CoV背板3,20的觀察，我們的結果表明，SARS樣緊急菌株所需的起始物質目前正在動物體內循環。值得注意的是，盡管全長SHC014-CoV可能需要額外的主干適應來介導人類疾病，但CoV家族中記錄的高頻重組事件強調了未來出現的可能性和進一步準備的必要性。迄今為止，動物種群的基因組學篩選主要用于在暴發設置21中識別新病毒。這里的方法擴展了這些數據集，以檢查病毒出現和治療效果的問題。我們認為帶有SHC014的病毒具有潛在的威脅，因為它們能夠在人類原代呼吸道培養物中復制，這是人類疾病的最佳模型。此外，在小鼠中觀察到的發病機制表明，含有SHC014的病毒有能力在哺乳動物模型中引起疾病，而無RBD適應。值得注意的是，與SARS-MA15相比，HAE培養物中全長SHC014冠狀病毒在肺中的向異性和相對于SARS-CoV Urbani的衰減表明，除ACE2結合外，包括棘突加工性、受體生物有效性或宿主免疫反應的拮抗性等因素可能有助于出現。然而，還需要對非人靈長類動物進行進一步的測試，才能將這些發現轉化為人類的致病潛能。重要的是，現有療法的失敗定義了進一步研究和治療發展的關鍵需求。有了這些知識，就可以生產出能夠防止2b組特異性CoV（如SHC014）出現的監測程序、診斷試劑和有效治療方法，并且這些方法可以應用到維持相似異質池的其他CoV分支。除了針對未來出現的病毒提供準備外，這種方法還必須在美國政府強制暫停功能獲得（GOF）研究的背景下加以考慮22。在先前的出苗模型（圖4a，b）的基礎上，SHC014-MA15等嵌合病毒的產生預計不會增加致病性。盡管SHC014-MA15相對于其親代小鼠適應的SARS冠狀病毒呈弱毒狀態，但類似的研究表明，用MA15主干內的野生型城市尖峰病毒檢測冠狀病毒的致病性時，小鼠沒有體重減輕，病毒復制減少23。因此，相對于Urbani spike–MA15 CoV，SHC014-MA15顯示了發病機制的增益（圖1）。根據這些發現，科學審查小組可能認為基于循環菌株構建嵌合病毒的類似研究風險太大，無法進行，因為不能排除哺乳動物模型中致病性增加的情況。再加上對小鼠適應株的限制以及利用逃逸突變體開發單克隆抗體，對CoV的出現和治療效果的研究可能會受到嚴重限制。總之，這些數據和限制是GOF研究關注的一個十字路口；必須權衡準備和減輕未來疫情爆發的潛力與產生更危險病原體的風險。在制定向前發展的政策時，重要的是要考慮這些研究產生的數據的價值，以及這些類型的嵌合病毒研究是否值得進一步調查，而不是所涉及的固有風險。

總的來說，我們的方法已經使用了亞基因組學的數據來確定一個潛在的威脅，由像CoV SHC014這樣的蝙蝠SARS造成的。由于嵌合體SHC014病毒能夠在人氣道培養物中復制，在體內引起發病機制并逃避當前的治療方法，因此有必要對循環中的SARS樣病毒進行監測并改進治療方法。我們的方法還開放了使用亞基因組數據來預測病毒出現，并將此知識應用于準備治療未來出現的病毒感染。方法病毒、細胞、體外感染和菌斑分析。將野生型SARS-CoV（Urbani）、小鼠適應型SARS-CoV（MA15）和嵌合型SARS-like-CoV分別培養在veroe6細胞（美國陸軍傳染病醫學研究所獲得）和Dulbecco改良的Eagle's培養基（Gibco，CA）和5%胎兒克隆血清（FCS）中（Hyclone，South洛根，UT）以及抗生素/抗真菌藥物（Gibco，Carlsbad，CA）。表達ACE2同源基因的DBT細胞（Baric實驗室，來源未知）已經在人類和麝貓身上得到了描述；bat ACE2序列是基于來自萊舍諾提犀牛的序列，表達bat ACE2的DBT細胞已經建立，如前所述8。假分型實驗類似于使用基于HIV的假病毒，如前所述10，并在表達ACE2同源基因的HeLa細胞（武漢病毒學研究所）上進行檢測。如前所述，HeLa細胞生長在添加10%FCS（Gibco，CA）的最小必需培養基（MEM）（Gibco，CA）中。在Vero E6，DBT，Calu-32b4和原代人氣道上皮細胞中的生長曲線如前所述。最近沒有一個工作細胞株的庫存被鑒定或檢測支原體，盡管最初用于生產工作庫存的種子庫存沒有受到污染。在北卡羅萊納大學教堂山學院審查委員會批準的方案下獲得了用于HAE培養的人肺。HAE培養物代表高分化的人氣道上皮細胞，包括纖毛上皮細胞和非纖毛上皮細胞以及杯狀細胞。如前所述，培養物在使用前在氣液界面上培養數周。簡單地說，用PBS洗滌細胞并接種病毒或在37℃下模擬稀釋的PBS中40分鐘。接種后，將細胞洗滌三次并添加新鮮培養基以表示時間“0”。在每個描述的時間點采集三個或更多的生物復制品。在任何樣本收集中均未使用盲法，樣本也未隨機化。所有病毒培養均在生物安全級（BSL）3實驗室進行，生物安全柜中有冗余風扇，如我們的第2組先前所述。所有人員都戴著電動空氣凈化呼吸器（呼吸方便，3M），帶著Tyvek套裝、圍裙和靴子，戴著雙手套。序列聚類與結構建模。

從Genbank或Pathosystems資源整合中心（PATRIC）下載代表性CoVs的全長基因組序列和S1區氨基酸序列，通過使用100個引導或使用PHYML（HTTPS://CODE.GoGoLe.COM/P/YMLL/）包的最大似然估計分別與ClustalX和系統發育進行比較。使用PHYML包生成最大似然樹。比例尺代表核苷酸替換。只有引導支持率高于70%的節點才被標記。結果表明，CoVs可分為αCoVs、βCoVs和γCoVs三個不同的系統發育類群。經典的亞群簇被標記為2a、2b、2c和2d（β-CoVs），1a和1b（α-CoVs）。利用Modeller（Max-Planck Institute bioinformics Toolkit）建立了SARS-RBD與ACE2復合物的結構模型，并基于晶體結構2AJF（Protein Data Bank）建立了其SHC014和Rs3367的同源性模型。在MacPyMol（1.3版）中可視化和操作同源模型。

SARS樣嵌合病毒的構建。野生型和嵌合型病毒均來源于SARS-CoV-Urbani或先前描述的相應小鼠適應型（SARS-CoV-MA15）感染克隆（ic）。用限制性內切酶消化法提取SHC014的spike序列質粒，連接到MA15感染性克隆的E和F質粒中。該克隆是從Bio-Basic設計和購買的，作為六個相鄰的cdna，使用已發表的序列，兩側是獨特的II類限制性內切酶位點（BglI）。隨后，對含有野生型、嵌合SARS-CoV和SHC014-CoV基因組片段的質粒進行擴增、切割、連接和純化。然后進行體外轉錄反應合成全長基因組RNA，如前所述轉染Vero E6細胞。從轉染的細胞中提取培養基作為種子儲備，用于后續實驗。在這些研究中使用前，通過序列分析確認了嵌合病毒和全長病毒。北卡羅萊納大學生物安全機構委員會和關注的兩用研究委員會批準了嵌合體突變體和全長SHC014-CoV的合成構建。道德聲明。

這項研究是根據美國國立衛生研究院實驗動物福利辦公室（OLAW）關于動物護理和使用的建議進行的。北卡羅來納大學教堂山分校（北卡羅來納州，許可證編號A-3410-01）的機構動物護理和使用委員會（IACUC）批準了這些研究中使用的動物研究方案（IACUC#13-033）。

小鼠和體內感染。雌性、10周齡和12月齡BALB/cAnNHsD小鼠從哈蘭實驗室訂購。小鼠感染如前所述。簡單地說，動物被帶進一個BSL3實驗室，在感染前接受1周的馴化。對于感染和減毒活疫苗接種，用氯胺酮和二甲苯嗪的混合物麻醉小鼠，并在激發時用50μl磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）或稀釋病毒對小鼠進行鼻內感染，每個感染組每次注射3或4只小鼠，如圖圖例所示。對于個別小鼠，感染標記，包括未能吸入全部劑量、從鼻子冒泡接種物或通過口腔感染，可能導致研究人員自行決定排除小鼠數據；感染后，未定義其他預先確定的排除或納入標準。在任何動物實驗中均未使用盲法，也未對動物進行隨機分組。為進行疫苗接種，年輕和老年小鼠用20μl體積的0.2μg含明礬的SARS-CoV雙滅活疫苗或模擬PBS進行足墊注射；22天后用相同的方案增強小鼠，21天后激發小鼠。在整個實驗期間，根據方案，對所有組的動物每天監測其疾病的臨床癥狀（駝背、皮毛皺褶和活動減少）。前7天每天監測體重下降情況，此后，體重監測繼續進行，直到動物恢復到初始體重或連續3天顯示體重增加。所有體重下降超過其初始體重20%的小鼠均被地面喂養，只要低于20%的臨界值，則每天進行多次進一步監測。如果小鼠的體重下降超過其初始體重的30%，則按照方案立即處死。任何被認為奄奄一息或不太可能康復的老鼠也被研究人員人道地犧牲。使用過量異氟醚實施安樂死，頸椎脫位證實死亡。所有的老鼠研究都是在北卡羅萊納大學（動物福利保證A3410-01）進行的，使用的是北卡羅萊納大學機構動物護理和使用委員會（IACUC）批準的方案。組織學分析。取左肺，在10%福爾馬林緩沖液（Fisher）中浸泡1周，不充氣。組織石蠟包埋，5μm切片由UNC-Lineberger綜合癌癥中心組織病理學核心設備制備。為了確定抗原染色的程度，使用市售的多克隆SARS-CoV抗核衣殼抗體（Imgenex）對切片進行病毒抗原染色，并通過如上所述的氣道和實質染色進行盲法評分20。圖片是用奧林巴斯BX41顯微鏡和奧林巴斯DP71相機拍攝的。如前所述，用先前鑒定的抗SARS-CoV抗體進行斑塊減少中和效價測定。簡言之，將中和抗體或血清連續稀釋兩倍，并與100株不同傳染性克隆SARS-CoV株的p.f.u.在37℃下孵育1h。然后將病毒和抗體加入帶有5×105 Vero E6細胞/孔的6孔板中，并具有多個重復（n≥2）。在37℃孵育1小時后，在培養基中用3毫升0.8%瓊脂糖覆蓋細胞。平板在37℃孵育2d，中性紅染色3h，計數斑塊。斑塊減少的百分比計算為（1-（有抗體的斑塊數/無抗體的斑塊數））×100。統計分析。

所有實驗均對兩個實驗組（兩種病毒或接種疫苗和未接種疫苗的隊列）進行對比。因此，病毒滴度和組織學評分的顯著差異是通過雙尾t檢驗來確定的。數據在被比較的各組中呈正態分布，且具有相似的方差。

生物安全和生物安保。報告的研究是在北卡羅萊納大學生物安全機構委員會批準實驗方案（項目名稱：產生類似蝙蝠非典的冠狀病毒的傳染性克隆；實驗室安全計劃編號：20145741；附表G編號：12279）后開始的。這些研究是在美國政府審議過程研究基金暫停有關流感、MERS和SARS病毒的功能獲得研究之前開始的（http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/Gain of Function.pdf）。這篇論文已經由美國國家衛生研究院（NIH）資助。要求繼續進行這些研究，并已獲得國家衛生研究所的批準。SARS-CoV是一種選擇性的病原體。這些研究的所有工作都是按照批準的SARS冠狀病毒、MERs冠狀病毒和其他相關冠狀病毒的標準操作程序（sop）和安全條件進行的。我們的機構CoV BSL3設施的設計符合微生物和生物醫學實驗室（BMBL）、美國衛生與公眾服務部、公共衛生服務部、疾病控制中心（CDC）和國家衛生研究所（NIH）的生物安全建議的安全要求。實驗室安全計劃已提交給UNC環境健康與安全部（EHS）和CDC，并已批準使用。進入設施需要電子卡接入。所有工人都接受了環境、健康和安全方面的培訓，以安全使用電動空氣凈化呼吸器（PAPR），并在BSL3設施中建立了適當的工作習慣和積極的醫療監督計劃。我們的CoV BSL3設施包括冗余風扇、風扇應急電源、生物安全柜和冷凍柜，我們的設施可以容納SealSafe鼠標架。分類為BSL3的材料包括SARS-CoV、bat-CoV前體菌株、MERS-CoV和從這些病原體衍生的突變體。在BSL3設施內，在經認證的二級生物安全柜（BSC）中進行感染性病毒試驗。所有工作人員都穿著工作服、泰威克西裝和圍裙、便簽和鞋套，雙手戴雙手套。瘋牛病三級使用者須接受由大學雇員職業健康診所（UEOHC）監督的醫療監督計劃，該計劃包括每年一次的身體接種、每年一次的流感疫苗接種，以及在瘋牛病三級工作期間與CoV感染有關的任何癥狀的強制性報告。所有的BSL3用戶都接受了暴露管理和報告協議的培訓，準備好自我隔離，并接受了在緊急情況下安全運送到當地傳染病管理部門的培訓。所有潛在的暴露事件都由環境健康安全部和環境與職業健康安全部報告和調查，并向疾病預防控制中心和國家衛生研究所提交報告。